Иммуногистохимия
Как я уже обещала ранее представляю статью про иммуногистохимию. С самого начала исследований в цитологии одним из важных вопросов был следующий: Как можно выявлять определенные структуры клетки при микроскопировании, а так же изменения в них?
И это было проблемой, так как красители окрашивали по химическим свойствам окрашиваемых веществ, то есть, окрашиваются все белки или все нуклеиновые кислоты. Плюс, каждая клеточная структура имеет свой набор белков и при изменении ее функционирования меняется количество этих белков и, возможно, их состав. То есть, был нужен метод, обеспечивающий выявление в клетке строго определенного белка и возможное изменение его количества. Но химические красители красят все белки, поэтому цитоплазма относительно гомогенна при окраске эозином, и так со всеми химическими реакциями на белок. Нужен реагент связывающийся со строго определенным белком, и этот реагент можно модифицировать для выявления. И здесь появилась возможность из самого неожиданного направления — иммунологии.
При попадании патогена в организм млекопитающего на него начинают вырабатываться антитела. Антитела — это белки вырабатываемые организмом позвоночного в ответ на проникновение чужеродного белка в организм. Чаще всего чужеродный белок является частью патогена, соответственно антитела связываются с белками патогена и инактивируют его. Если интересен механизм, посмотрите статью на этом сайте «Что происходит в организме при вакцинации». Так вот: белок человека для крысы или кролика чужероден и тоже при введении в организм запустит выработку антител, которые будут связывать этот белок. Белок не опасен для крысы, но иммунная система реагирует на любой чужеродный белок, выделяя антитела. Поэтому в крови крысы, которой ввели человеческий очищенный белок, через несколько дней начинают циркулировать белки связывающиеся с этим белком и только с ним.
Если взять у крысы кровь и выделить из нее все антитела, этот набор можно нанести на хроматографическую колонку, в которой с носителем химически соединен белок, который вкалывали крысе. Нужные антитела свяжутся с этим белком и осядут на носителе, а остальные антитела не свяжутся и будут смыты с колонки. Затем создаем условия, в основном незначительно меняя рН среды, в результате аминокислоты во взаимодействующих белках меняют свой заряд, в итоге антитела отсоединяются от белка носителя и переходят в раствор. В этом растворе - те антитела, которые нужны, то есть связывающие нужный белок (тот, который выделили и вкололи в крысу).
Дальше полученные антитела химически модифицируют, присоединяя к белку флуоресцирующую молекулу. Таким образом, готов реагент, который связывает определенный белок и этот комплекс начинает светится (флуоресцировать), если освещать светом, чья длина волны активирует (возбуждает) флуоресцирующую молекулу в комплексе, и она начинает светится.
Теперь можно готовить срез органа к анализу. Забор делается также, но объем кусочка должен быть меньше. В данном случае нельзя использовать фиксаторы, так как при фиксации происходит денатурация белка. При денатурации меняется форма белка, а антитело вырабатывается на белок в исходной (нативной) форме, соответственно с белком с изменившейся формой антитело не свяжется. Поэтому для фиксации используют замораживание, которое не приведет к денатурации. Затем проводят приготовление срезов с помощью криотома (микротом для получения резов из замороженного материала), этакий гибрид микротома и морозильника. Затем срез переносят на предметное стекло. Далее на срез наносят раствор антител в комплексе с флуоресцентной молекулой в буфере для более качественного связывания. Эти антитела связываются с белком, который заинтересовал исследователей, которые выделили этот белок и вкололи его крысе для получения антител.
Антитела образуют комплекс с белком и закрепляются на срезе. Не связавшиеся антитела смывают. Далее стекло помещают в микроскоп с лампой, изучающей свет с длиной волны, активирующей метку на антителе. В результате комплекс белок/антитело начинает светиться и можно выявить где в клетке находится интересующий белок, а по интенсивности свечения определить количество этого белка (слабое свечение - мало белка, и наоборот).
Антитела к разным белкам можно соединить с разными флуоресцентными метками и можно на одном срезе посмотреть распределение разных белков в клетке.
Данный метод используется для научных исследований, а так же в диагностике заболеваний, например, онкологических.
Результаты можно увидеть на изображении в начале статьи.
Источник изображения:
Xiang-Shan Yuan et al., Whole-Brain Monosynaptic Afferent Projections to the Cholecystokinin Neurons of the Suprachiasmatic Nucleus
ORIGINAL RESEARCH article Front. Neurosci., 05 November 2018
Sec. Sleep and Circadian Rhythms
Volume 12 - 2018 | https://doi.org/10.3389/fnins.2018.00807