Методы электронной микроскопии
Световая микроскопия много дала при исследовании тканей, но при исследовании клеток четко выявлялись ядро и некоторые крупные органоиды вроде хлоропластов. Однако структура самих органоидов не могла быть выявлена с помощью световой микроскопии. Это связано с разрешающей способностью.
Разрешающая способность микроскопа — это способность выдавать чёткое раздельное изображение двух близко расположенных точек объекта.
Основная формула разрешающей способности микроскопа: d = 0,5λ/А, где длина волны — λ и числовая апертура объектива — А.
Усредненная длина волны для светового микроскопа — 0,5 мкм. Максимальное значение апертуры объектива равно единице. Поэтому максимальная разрешающая способность оптического микроскопа 0,25 мкм. Так что не от хорошей жизни начались эксперименты с более коротковолновыми источниками света, на пример ультрафиолетовыми лампами, но они не давали решающего изменения разрешающей способности. Пока в 1931 году Р. Руденберг не создал первый в мире электронный микроскоп. В данном методе использовался пучок электронов.
Максимально достижимое разрешение по точкам определяется формулой
Rs= 0,65 (Cs・λ 3 )1/4
где Rs – разрешение по точкам, Cs - коэффициент сферической аберрации объективной линзы просвечивающего электронного микроскопа, λ – длина волны электрона.
Для ускоряющего напряжения 200 кВ длина волны электрона λ=0,0025 нм. Коэффициент сферической аберрации объективной линзы Cs=1 mm (JEM-2100, HR polepiece). Таким образом, разрешение по точкам для вышеприведенных значений составит Rs=0,23 нм.
Это наиболее современные данные по возможности электронной микроскопии [1]. Более старые микроскопы давали разрешение 5 — 15 нм, но это разница в разы, а не в тысячи раз: 1 мкм и 1 нм отличаются в 1000 раз. Так что электронный микроскоп стал реальной методологической революцией для цитологов. Данная технология позволила рассматривать строение не только клеток, но и их составляющих органелл.
Основным принципом электронной микроскопии является облучение специально подготовленного препарата пучком электронов и в этом случае выделяют два основных типа электронной микроскопии:
1. Просвечивающая электронная микроскопия;
2. Сканирующая электронная микроскопия.
Так как подход к облучению несколько отличается, то отличаются и подготовка препарата и метод фиксации результата, так что методы приходится рассматривать по отдельности.
Просвечивающая электронная микроскопия
В данном случае на препарат, находящийся в вакууме поступает пучок электронов, роль оптических линз, которые используются в обычных микроскопах, здесь отведена электронному полю. Именно оно и фокусирует электроны. Электромагнитное поле формируется электромагнитными катушками. Препарат может пропускать электроны и поступать на флюоресцирующий экран или рентгеновкую пленку пропускающие электроны участки называют электрон-прозрачными, а также препарат может задерживать электроны, которые не попадают на флюоресцирующий экран или рентгеновкую пленку, такие участки называют электрон-плотными, в чем-то это похоже на негатив обычной пленки (светлые участки становятся темными и наоборот), то в эпоху электронных фотоаппаратов это сложно представить, так что архивы и хорошие учебники физики в помощь для лучшего понимания.Препарат требует особой подготовки которая будет описана ниже:
1. Фрагменты ткани или органа отрезать острым лезвием (бритвой или скальпелем), поместить в охлажденный фиксирующий раствор и разрезать на кусочки объемом около 1-2 мм3. Кусочки поместить в пробирки с фиксатором, разведенном на буфере, для дальнейшей обработки на 1-16 ч. в зависимости от температуры фиксации.
2. Материал промыть буфером 4 раза по 5-15 мин. Отмытый материал можно хранить в холодильнике до 2 недель.
3. Постфиксировать материал в 0.5-2% растворе OsO4 45 мин.-2 ч. при комнатной температуре или до 16 ч. при +4°С.
4. Материал промыть буфером и/или водой 3-4 раза по 5-10 мин. Отмытый материал можно хранить в холодильнике 1-2 дня.
5. Материал можно дополнительно контрастировать 0.5-2.5% раствором ацетатом урана на воде 30 мин., хорошо отмыв водой после постфиксации тетраоксидом осмия или 0.5-2.5% раствором ацетатом урана на 70% этаноле 30-90 мин. во время обезвоживания после 70% спирта.
6. Для обезвоживания провести материал через серию спиртов возрастающих концентраций (30%), 50%, 70%, 95%, инкубируя в каждом растворе по 5-10 мин., смесь спирт:ацетон в соотношении 1:1 два раза по 5-10 мин., обезвоженный ацетон 2 раза по 5-10 мин. Обезвоживание и последующее заключение в смолу лучше проводить на качалке BioSan Multi Bio 3D или BioSan MR-1.
7. Для заключения в эпоксидную смолу провести материал через серию разведений смолы в ацетоне (10%), 30%, 50%, 70%, 100%, увеличивая время инкубации в каждой смоле от 15-30 мин. до 1-4 ч. В последней смоле можно выдержать 16 ч. (ночь).
8. Переложить материал в свежую смолу (разложить по ванночкам или капсулам) для полимеризации. Выдержать ночь при комнатной температуре или при 45°С.
9. Полимеризовать блоки согласно указаниям производителя смолы. Для придания готовым блокам большей твердости можно после извлечения из термостата их поместить на короткое время в морозилку, для придания большей пластичности – выключить термостат и оставить в нем блоки до полного остывания.
10. Готовые блоки в эпоксидной смоле нарезать с помощью ультратома со стеклянными ножами.
11. Полученные срезы контрастировать с помощью цитрата свинца, а затем микроскопировать [2].
Полученные препараты позволяют изучать структуру органелл, белки и ДНК задерживают электроны, формируя электрон-плотные фрагменты препарата.
Электронная микрофотография митохондрии. 1 — криты с комплексом АТФ-азы, 2 — рибосомы в матриксе митохондрии, 3 — рибосомы в гранулярном ЭПС, 4 — митохондриальная ДНК. Рисунок взят на сайте [3].
Как видно из рисунка электрон-плотные компоненты — это или скопления белка, или комплексы белок/нуклеиновая кислота.
Сканирующая электронная микроскопия
Сканирующая электронная микроскопия — метод анализа поверхности образцов при сканировании выделенного участка сфокусированным потоком ускоренных электронов. В результате взаимодействия пучка с образцом, электроны попадают на детектор и изображение считывается с поверхности образца «строка за строкой» и выводится на монитор. В результате получается трехмерное изображение исследуемой поверхности. Но для этого требуется другой способ приготовления препарата, что будет рассмотрено ниже:
Для подготовки образцов тканей перед исследованием методом сканирующей электронной микроскопии берут образцы ткани и погружают в фиксирующую жидкость. Образцы отмывают от фиксатора и дегидратируют. Затем образцы, не высушивая, помещают в смесь дегидранта и камфена, затем в расплавленный камфен. После извлечения образцов из камфена их высушивают на воздухе при комнатной температуре в беспыльных условиях. Далее образцы монтируют на подложки и напыляют токопроводным слоем. Подготовленные образцы исследуют в сканирующем электронном микроскопе. Время каждого этапа подготовки образцов к микроскопическому исследованию подбирают индивидуально, в зависимости от размера образца.
Практическое использование способа иллюстрируется следующим примером. Для исследования взяли образцы надкостницы 1-1,5 мм диафиза большеберцовой кости собаки и фиксировали в течение 24 часов в смеси 2%-ных растворов формальдегида и глутаральдегида. Затем их промывали сначала в проточной (2 часа), в дистиллированной воде (2 часа), в фосфатном буфере (2 часа) и обезвоживали поэтапно в 70% (24 часа) и по 2 часа в 80%, 90%, 96%, 100% этиловом спирте, пропитывали в смеси камфен/дегидрант (в соотношении: 1/1, 2/1, 3/1 по 2 часа), при t=51°C, пропитывали в течение 12 часов расплавленным камфеном. Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре, после чего осуществляли монтаж объектов на держатели образцов или промежуточную подложку.
После напыления серебром в ионном напылителе IB-6 препараты исследовали при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Япония). В подготовленном образце сохранены структура волокнистого и фибриллярного остова, форма клеток и микрорельеф клеточной поверхности.
Предложенный способ используется в ФГУ РНЦ «ВТО» им. академика Г.А.Илизарова в научном экспериментально-клиническом отделе морфологических исследований. Он позволяет предотвращать деформацию структур биологических объектов в процессе высушивания, упрощает процедуру и снижает ее себестоимость. [4]
Схема организации микроскопа для сканирующей электронной микроскопии [5].
На рисунке ниже представлены результаты сканирующей электронной микроскопии для пыльцы [6].
Можно получить ультраструктуру поверхности микроскопических объектов. Данный метод часто используется химиками для дефектоскопии.
Электронная микроскопия активно используется в цитологии, молекулярной биологии для изучения органелл и белковых комплексов.
Более подробно этот метод с практикой изучается в соответствующих ВУЗах.
Список ссылок
1. С.М. Жарков Методы современной просвечивающей электронной микроскопии в исследовании материалов Journal of Siberian Federal University. Chemistry 4 (2009 2) 294-306
2. https://researchpark.spbu.ru/methods-biomed-rus/1913-bio-metod-07-rus
3. https://www.biology-pages.info/C/CellularRespiration.html
4. https://patents.google.com/patent/RU2397472C1/ru
5. Д. А. Полонянкин, А. И. Блесман, Д. В. Постников, А. А. Теплоухов Теоретические основы растровой электронной микроскопии и энергодисперсионного анализа наноматериалов : учеб. Пособие / [Д. А. Полонянкин и др.] ; Минобрнауки России, ОмГТУ. – Омск : Изд-во ОмГТУ, 2019. – 116 с. : ил.
6. https://sernia.ru/training/rastrovyj-mikroskop/