Светооптические методы цитологии и гистологии
Цитология изучает клетки, но подавляющее большинство клеток не видно невооруженным глазом. Поэтому необходимы специальные методы и приборы для выявления и изучения клеток.
Первым человеком наблюдавшим клетки был Э. Левенгук. Его хобби было изготовление линз. Он достиг в в этом такого совершенства, что разглядывая через свои линзы капли воды, он увидел маленькие прозрачные полужидкие и подвижные образования, которые он сравнил с «мешочками с жидкой кашей». Так были, впервые, обнаружены клетки простейших.
Примерно в это же время Р. Гук разработал микроскоп, содержащий систему линз, который можно считать прообразом современного микроскопа. Система линз и поток света через нее показаны на рисунке.
Поток света сквозь клетки и разность преломления разными средами, позволяют рассмотреть клетку в среде а также отдельные структуры например клеточную стенку растений. Так же можно увидеть окрашенные клетки или структуры, например, хлоропласты, эритроциты, окрашенные антоцианами клетки кожицы лука.
Клетки простейших в виде капли помещаются на стекло (предметное), затем накрываются еще одним более тонким стеклом (покровное) — такой препарат называют раздавленная капля. Также можно использовать окрашенные части, в которых клетки лежат в один слой, например, кожица красного лука, эпидермис листа, лист водоросли Элодея канадская, помещенные в каплю воды или физиологического раствора (0,9%-ный раствор хлорида натрия), также представлены на рисунке. Такие препараты называются витальными или временными. 
Но большинство органов и тканей объемные и неокрашенные, кроме того не все можно рассмотреть по различиям преломления света. Поэтому необходимо нарезать часть органа на слои толщиной в идеальном случае толщиной в одну клетку и сохранить препарат на длительный срок, такие препараты называют постоянными. Поэтому мы рассмотрим технику приготовления постоянных препаратов. Эта техника состоит из следующих этапов:
1. взятие материала;
2. фиксация;
3. промывка в воде;
4. обезвоживание и уплотнение;
5. заливка;
6. приготовление срезов;
7.окрашивание;
8. заключение срезов.
1. Взятие материала.
Для гистологического исследования берут кусочки органов и тканей величиной не более 1 см³. Материал должен быть максимально свежим, чтобы исключить разрушение структур.
2.Фиксация.
Взятый для гистологического исследования материал сразу же должен подвергаться фиксации. Фиксация – метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры. Это достигается путем воздействия на ткань специальных растворов (фиксаторов). Наиболее существенным изменением, происходящим в тканях под воздействием фиксатора является процесс свертывания (коагуляции) белков. Количество фиксатора следует брать в 20-100 раз больше объема кусочка фиксируемого материала.
Существуют фиксаторы простые и сложные. К простым относятся 10-20% раствор формалина, 96º спирт, 100º (абсолютный) спирт, 1-2% раствор осмиевой кислоты и др. Сложные фиксаторы: спирт – формол (спирт 70º — 100 мл. и формалин 2-5 мл.) жидкость Ценкера (сулема – 5 г, сернокислый натрий — 1 г., двухромовокиолый калий – 2,5 г, дистиллированная вода – 100 мл., ледяная уксусная кислота 5 мл.) и др. Продолжительность фиксации – от нескольких часов до 1 суток и более в зависимости от свойств фиксатора и характера исследуемого материала.
3.Помывка в воде.
После фиксации материал промывают (чаще всего в течение нескольких часов в проточной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей.
Изучить с помощью микроскопа такие фиксированные кусочки органов невозможно, т. к. они не прозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его надо разрезать на очень тонкие пластинки – срезы, толщина которых измеряется в микрометрах. Такие срезы получают с помощью специальных приборов – микротомов. Но для того, чтобы резать на микротоме кусочек ткани, ее надо предварительно уплотнить. Это достигается путем пропитывания застывающими жидкостями – расплавленным парафином. Парафин в воде не растворяется, и поэтому промытый после фиксации кусочек ткани необходимо предварительно обезводить, и только затем пропитывать.
4. Обезвоживание.
Обезвоживание ткани производятся постепенно (чтобы не произошло сморщивания) путем проведения ее через спирты возрастающей крепости: 50º, 60º, 70º, 80º, 90º, 96º, 100º. В каждом спирте кусочки находятся от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины кусочка.
5.Уплотнение (заливка).
При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол). Заливка в парафин. При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37º до 1 суток и более. Дальнейшая заливка проводится в термостате при температуре 54º -56º в трех порциях парафина.
Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем эти коробочки или чашки после появления на поверхности парафина пленки, погружают в воду.
Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки.
Уплотнения также можно добиться замораживанием кусочка органа (срочная биопсия).
6. Приготовление срезов.
Срезы с блоков изготовляются на микротоме. Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож. Существует механизм, поднимающий объектодержатель с блоком на заданное количество микрометров. Это позволяет при каждом скольжении ножа в плоскости параллельной поверхности блока получать срезы толщиной 5-10 микрометров с парафиновых блоков.
Следующий этап связан с тем, что различия в преломлении света в таких препаратах очень малы поэтому препараты окрашивают.
7. Окрашивание.
Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле).
Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта.
Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми красителями и ими окрашиваются (ацидофильные, оксифильные структуры), другие реагируют с основными красителями и окрашиваются преимущественно ими (базофильные структуры). Некоторые структуры окрашиваются и кислыми и основными красителями.
По происхождению различают краски естественные, к которым относятся краски растительного и животного происхождения, и краски искусственные. Краской растительного происхождения является гематоксилин, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и в Армении. К краскам животного происхождения относится кармин, который добывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении и др. В настоящее время большинство красок готовят синтетически(искусственные краски).
По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры.
Ядерные краски – гематоксилин, кармин, сафранин, метиленовая синь, азур, тионин. Цитоплазматические краски – эозин, пикрофуксин.
Существуют специальные краски и реактивы: судан Ш (окрашивает липиды в оранжевый цвет), осмиевая кислота (импрегнируемые ею липиды окрашиватся в черный цвет), резорцинфуксин Вейгерта (дает темно-синюю окраску эластических волокон), орсеин (окрашивает эластические волокна в бурый цвет). Метиленовый синий окрашивает гранулярный эндоплазматический ретикулум нервных клеток в синий цвет, а при импрегнации серебром компоненты нервных клеток приобретают коричневый цвет.
Чаще всего для окрашивания гистологических срезов применяется окрашивание раствором гематоксилина (приготовленным по методу Бемера) и 1-2% эозином.
8. Заключение среза.
Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70º, 96º), просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам), смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду.
Помимо, описанных выше типов красителей существуют еще несколько типов красителей. Конечно описать все в одной короткой статье не описать, но хотя бы некоторые.
Витальные красители.
Это красители используемые для живых клеток в витальных препаратах. Например если взять сухие дрожжи развести водой и добавить немного сахара и пару капель метиленового синего и оставить рядом с батареей центрального отопления минут на 30, то потом в капле воды можно будет увидеть голубоватые клетки дрожжей. Еще один витальный краситель — акридиновый оранжевый встраивается в ДНК в ядре которое при облучении ультрафиолетовым излучением начинает светиться зеленым светом, этот краситель относится к так называемым флуоресцентным красителям. Чаще всего флуоресцентные красители химически присоединяют к антителам, которые используют еще в одном методе окраски препаратов — иммуноцитохимия. Метод иммуноцитохимии находится на стыке нескольких наук, поэтому будет рассмотрен в отдельной статье.
Красители для цитохомиии.
Некоторые органеллы содержат большое количество специфических для данной органеллы ферментов. Ферменты катализируют биохимические реакции. Препарат для цитохимии замораживают нарезают на микротоме, срез помещают на предметное стекло и заливают раствором субстрата объединенного с красителем, комплекс субстрата с красителем специфичен для определенного фермента. В органеллах, где этого фермента много реакция пройдет быстро, субстрат превратится в продукт, краситель высвободится и органелла, богатая ферментом, окрасится.