Основной метод расчета температуры плавления (Tm)

Используются два стандартных расчетных подхода.

Для последовательностей менее 14 нуклеотидов формула выглядит следующим образом:

Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4

где w,x,y,z количество оснований A,T,G,C в последовательности.

Для последовательностей длиннее 13 нуклеотидов используется уравнение

Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)

Когда вырожденные нуклеотиды включены в последовательность праймера (Y, R, W, S, K, M, D, V, H, B или N), эти нуклеотиды будут заменены внутри до расчета минимальной и максимальной Tm.

Пример:
Последовательность праймера:                  CTCTRYCTWSCTCTCT
Последовательность расчета минимальной Tm:    CTCTATCTAGCTCTCT
Последовательность расчета максимальной Tm:   CTCTGCCTAGCTCTCT

Оба уравнения предполагают, что отжиг происходит в стандартных условиях: 50 нМ праймера, 50 мМ Na⁺ и рН 7,0.

Base-Stacking метод расчета температуры плавления (Tm)

Этот подход использует термодинамические концепции для вычисления Tm, описанные в источниках:

J SantaLucia Jr. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Feb 17;95(4):1460-5. NCBI NCBI

N von Ahsen, M Oellerich, V W Armstrong, E Schütz. Application of a thermodynamic nearest-neighbor model to estimate nucleic acid stability and optimize probe design: prediction of melting points of multiple mutations of apolipoprotein B-3500 and factor V with a hybridization probe genotyping assay on the LightCycler. Clin Chem. 1999 Dec;45(12):2094-101. NCBI